上海富雨生物科技有限公司

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技术服务、试剂、细胞库 / 细胞培养、ELISA 试剂盒、耗材、抗体
经营模式：
生产厂商

Shuffle T7-K12 感受态细胞

人阅读发布时间：2021-04-16 22:23

Shuffle T7-K12 感受态细胞

产品信息：
组成	BC208-01	BC208-02
Shuffle T7-K12 Competent cells	10×100μl	20×100μl
pUC19（0.1ng/μl）	5μl	5μl

储存条件：-70℃保存，避免反复冻融。

产品说明：

Shuffle T7-K12菌株来源于大肠杆菌K12菌株，适用于T7启动子启动的蛋白表达。细胞内组成型表达的二硫键异构酶DsbC不仅有利于表达蛋白形成正确的二硫键，并具有分子伴侣的功能，帮助不含二硫键的蛋白正确折叠。T7 RNA聚合酶基因整合在细菌染色体上的lac操纵子区域，组成型表达的lac阻遏蛋白能降低基因的背景表达，有利于毒性蛋白的表达，没有λ前噬菌体序列，具有抗T1噬菌体感染特点。Shuffle T7-K12感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率大于106 cfu/μg。

基因型：

F′ lac, pro, lacIq /△(ara-leu)7697 araD139 fhuA2 lacZ::T7 gene1△(phoA) PvuII phoR ahpC* galE (or U) galK λatt::pNEB3-r1-cDsbC (SpecR, lacIq)△trxB rpsL150(StrR)△gor△(malF)3
菌株抗性：对氨苄青霉素，氯霉素，卡那霉素和四环素敏感，对链霉素和壮观霉素有抗性。

质粒转化步骤：

将感受态细胞置于冰水浴中化冻。待细胞刚化冻后，加入质粒 DNA 到细胞中，用手指拨打管底，轻轻混匀；
冰水浴中放置 30 分钟，不要晃动；
42℃热击 60 秒钟，不要晃动；
冰水浴中放置 2 分钟，不要晃动；
加入 500μl 无菌的SOC 或 LB 培养基；

6. 置于 30℃摇床中，150-200rpm，复苏培养 60 分钟；
7. 取 50-100μl 菌液涂布在含有抗性的LB 平板上。待液体吸干后，倒置平板 30℃培养 12-24 小时。
（平板划线分离法：复苏培养结束后，12000rpm 离心 30 秒钟，弃掉上清，留 100μl 左右的液体，用 200μl 吸头轻轻吹打散菌块，取 10μl 重悬的菌液分多点滴在平板上，倾斜吸头，用吸头头部的侧面将滴在平板上的液体来回划线。这个方法可以获得更多更大的单克隆菌落。）
（质粒快速转化步骤：将步骤 2 的时间缩短到 5 分钟，对于氨苄青霉素抗性的质粒，步骤 4 完成后，可直接涂
布或划线于含抗生素的平板上。其它抗性的质粒仍需 40-60 分钟的复苏培养。）

蛋白表达步骤：

1. 挑取单菌落，接种到含 5ml 带抗生素的 LB 培养基中；
2. 30℃，200rpm 震荡培养细菌至对数生长期（OD₆₀₀=0.4-0.8）；

加入 IPTG 到终浓度为 0.4mM，30℃诱导 4 小时或 16℃诱导过夜；
诱导完成后，离心收集菌体，用合适的方法（如考马斯亮蓝染胶法，Western-Blot法或酶活性分析法）分析菌体裂解物的总蛋白、上清和沉淀组分，明确表达产物的表达状况（可溶性或不溶性表达）；
重组蛋白大量表达时，可用 10ml 过夜培养物转接到 1L 培养基中，当培养到 OD₆₀₀=0.4-0.8 时，加入终浓度为 0.4mM 的 IPTG，30℃诱导 4 小时或 16℃诱导过夜（不同蛋白表达的最佳条件有所不同，需在实验中优化）。