EHA105 农杆菌电转感受态细胞操作步骤

EHA105 农杆菌电转感受态细胞产品说明：
EHA105由EHA101菌株改造而来(Hood et al., 1993)，为农杆菌C58型背景，核基因中含有利福平抗性基因(Rif)。此菌株还携带一种自身转运功能丧失的质粒(disarmed Ti plasmid)。EHA105菌株含有胭脂碱型Ti质粒pEHA105 (pTiBo542DT-DNA),该质粒含有vir基因(vir基因是TDNA插入植物基因组所必需的元件，pEHA105(pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可辅助植物双元表达载体的T-DNA的转移）。pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)质粒还含有Str抗性基因，赋予EHA105菌株链霉素抗性。EHA105农杆菌适用于水稻、烟草等植物的转基因操作。EHA105 电转感受态特别适用于大质粒的转化，经pCAMBIA2301M 质粒检测转化效率大于105 cfu/μg DNA。
EHA105 农杆菌电转感受态细胞操作方法：
1. 电极间距为0.1cm的电转杯（Gene Pulser®/MicroPulser™ electroporation cuvettes）插入碎冰中，压实冰面，冰中静置5分钟，使电转杯充分降温。（电转杯重复使用方法：每次用完后，用大量的自来水冲洗干净去掉菌液和DNA，用蒸馏水洗3遍，将其泡在75%乙醇中30分钟，取出杯子，沥干液体，放在超净台中，使乙醇充分挥发，盖上盖子放干燥地方备用。）
2. 取-70℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入1μg质粒DNA（洗脱或溶解质粒的溶液中离子不能太高，或用双蒸水稀释），用手拨打管底混匀，立即插入冰中，在超净台中用无菌吸头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。
3. 启动电转仪，设置电击参数：C=25μF，PC=200ohm，V=2400V（此参数为BioRad公司推荐，依据不同电转仪设置针对农杆菌合适的电击参数）。用纸巾擦掉电转杯外部的水分，将电转杯快速放入电转槽中进行电击步骤。电击完成后，将电转杯快速插入冰中，加入700μl无抗生素的LB并转移到原来保留的感受态空管中，28℃，150-200 rpm振荡培养2-3小时。
4. 6000rpm离心一分钟收菌，留取200μl左右上清轻轻吹打重悬菌块，取100μl的菌液涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天（当平板只含有50μg/ml kan时，28℃培养48h即可；平板中同时加入50μg/ml kan，20μg/ml rif时，需28℃培养60h；如果使用的平板含有50μg/ml rif则需要28℃培养72-90h）。组成BC307-01EHA105 Electrocompetent cells 20×50μlpCAMBIA2301 (1μg/μl) 1 支
EHA105 农杆菌电转感受态细胞注意事项：
1. 混入质粒时应轻柔操作，加入质粒的体积不大于感受态体积的1/10，质粒不纯或超大质粒会导致转化效率急剧下降。
2. 平板上菌落过多时，菌落很小。为了获得大的菌落，应减少质粒用量或减少涂布量，或将菌落转移到新平板上生长。
3. 利福平使用的工作浓度浓度不应高于25 μg/ml，过高的利福平浓度会降低生长速度和转化效率。
4. 利福平具有防止止杂菌生长筛选农杆菌的作用；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti 质粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时可不考虑添加链霉素或庆大霉素，Ti 质粒丢失的概率极低(可忽略)。
我公司目前感受态种类齐全，具体如下：TOP.10感受态细胞，DH5α感受态细胞，JM109感受态细胞，XL1-Blue感受态细胞，BL21感受态细胞，BL21(DE3)感受态细胞，BL21(DE3)plysS感受态细胞，M15感受态细胞，Mach1-T1 Phage Resistant感受态细胞，Rosetta(DE3)感受态细胞，DH10B感受态细胞，OrigamiB(DE3)感受态细胞，OmniMAX2-T1 Phage Resistant感受态细胞，JM110感受态细胞，XL10-Gold感受态细胞，Stbl3感受态细胞，DH10BAC感受态细胞，DB3.1感受态细胞，LBA4404农杆菌感受态细胞，AGL1农杆菌感受态细胞，EHA105农杆菌感受态细胞，GV3101农杆菌感受态细胞等。如有需要，欢迎来电来函联系。