上海富雨生物科技有限公司
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EHA101农杆菌感受态细胞
人阅读 发布时间:2022-12-04 09:49
EHA101农杆菌感受态细胞
EHA101 Chemically Competent Cell产品编码: 保存条件: -80℃
产品规格:
EHA101 | 20×100 μl |
pK7WGF2 (control vector) | 10 ng/μl 10 μl |
基 因 型
C58 (rif R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kanR, strepR) Nopaline
简 要 说 明
EHA101菌株为C58型背景,核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif,为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA),此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件,pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏,但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。
pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) 型Ti质粒含有筛选标签:strep、kan,赋予EHA101菌株链霉素抗性和卡那霉素抗性,适用于玉米、水稻、烟草等植物的转基因操作,经pK7WGF2质粒检测转化效率可达104 cfu/μg DNA。
操 作 说 明
1、 取-80℃保存的农杆菌感受态于冰上待其部分融化,处于冰水混合状态时插入冰中。
- 每100 μl 感受态加1 μg(体积不大于10 μl)质粒DNA,用手拨打管底混匀,依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、28℃水浴5分钟、冰浴5分钟。
4. 6000 rpm离心一分钟收菌,留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培养箱培养2-3天。
注 意 事 项
1、 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10;质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转化效率急剧下降;质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。
2、 混入质粒时应轻柔操作,转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3、 利福平浓度不应高于25 μg/ml,过高的利福平浓度不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50 μg/ml kan,若所用平板同时含有20 μg/ml rif则转化效率降低到1/2。
4. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌;根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失,但链霉素不利于农杆菌的转基因操作,所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素,Ti质粒丢失的概率极低 (可以忽略)。
备注:
1、农杆菌相关抗生素配方:
抗生素 | 配方 | 原液浓度 | 工作浓度 |
羧苄青霉素 (carb) | 双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
硫酸卡那霉素 (kan) | 双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
链霉素 (strep) | 双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 10 mg/ml | 50 μg/ml |
利福平 (rif) | DMSO溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 10 mg/ml | 20 μg/ml |
庆大霉素 (gent) | 双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 20 mg/ml | 40 μg/ml |
- 常用农杆菌抗性: (R:抗;S:敏感。)
农杆菌菌株 | 羧苄青霉素(carb) | 链霉素(strep) | 利福平(rif) | 庆大霉素(gent) | 硫酸卡那霉素(kan) |
AGL-1 | R | R | R | S | S |
EHA101 | S | R | R | S | R |
EHA105 | S | R | R | S | S |
LBA4404 | S | R | R | S | S |
GV3101 | S | R | R | R | S |