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GV3101农杆菌电转感受态细胞

人阅读 发布时间:2022-12-04 10:07

GV3101农杆菌电转感受态细胞

GV3101 Electroporation-Competent Cell
产品编码:                          保存条件-80℃   
产品规格:
GV3101 20×50μl
pCAMBIA2301control vector 10ng/ul       10ul
基   因   型
C58 (rif R) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR/strepR) Nopaline
简  要  说  明
GV3101菌株为C58型背景,核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif,为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pMP90 (pTiC58DT-DNA),此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件,pMP90 (pTiC58DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏,但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。
pMP90 (pTiC58DT-DNA)Ti 质粒含有筛选标签:Strepgent,赋予GV3101菌株链霉素和庆大霉素抗性,适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作。
开发的GV3101电转感受态特别适用于大质粒的转化:经pCAMBIA2301质粒(size:11633bp)检测转化效率可达5×104cfu/μg;经pCAMBIA2301-ZH质粒(size:40kd)检测转化效率可达5×103cfu/μg
操  作  说  明
1. 0.2cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,使乙醇充分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。
  1.  -80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟,待其融化,加入1-5ug质粒DNA(质粒体积不大于6ul,最好用试剂盒抽提,双蒸水溶解),用手拨打管底混匀,立即插入冰中,用200ul枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中,盖上杯盖,空管保留待用。
  2.  启动电转仪,设置参数:C=25uFPC=200ohm,V=2400V(此参数为Biorad 推荐,使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中,加入700ul 无抗生素的LB并转移到感受态空管中,28℃振荡培养2~3小时。
4. 6000rpm离心一分钟收菌,留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LBYEB平板上,倒置放于28℃培养箱培养2-3(当平板只含有50ug/ml kan 时,28℃培养48h即可;平板中同时加入50ug/ml kan20ug/ml rif 时,需28℃培养60h;如果使用的平板含有50ug/ml rif 则需要28℃培养72-90h)。
注 意 事 项
  1.   感受态细胞最好在冰上融化。
  2.  混入质粒时应轻柔操作。
3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
备注:
  1. 农杆菌相关抗生素配方:
抗生素 配方 原液 工作液
羧苄青霉素(carb 双蒸水溶解,0.22um滤膜过滤除菌 50mg/ml 50ug/ml
硫酸卡那霉素(kan 双蒸水溶解,0.22um滤膜过滤除菌 50mg/ml 50ug/ml
链霉素(strep 双蒸水溶解,0.22um滤膜过滤除菌 10mg/ml 50ug/ml
利福平(rif DMSO溶解,0.22um滤膜过滤除菌 10mg/ml 20ug/ml
庆大霉素(gent 双蒸水溶解,0.22um滤膜过滤除菌 20mg/ml 40ug/ml
 
  1. 常用农杆菌抗性:(R:抗;S:敏感)
农杆菌菌株 羧苄青霉素(carb) 链霉素(strep) 利福平(rif) 庆大霉素(gent) 硫酸卡那霉素(kan)
AGL-1 R R R S S
EHA105 S R R S S
LBA4404 S R R S S
GV3101 S R R R S
  注意事项
  1.  加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10 ;质粒不纯或存在盐,乙醇等污染,转化效率急剧下降;若转化大质粒或想获得较高转化效率,推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。
  2.  混入质粒时应轻柔操作。
  3.  转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
  4.  利福平浓度不应高于25ug/ul,过高的利福平浓度不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50ug/ml kan,若所用平板含有20ug/ml rif则转化效率降低到1/2
  5.  培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌;根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失,但链霉素不利于农杆菌的转基因操作,所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素,Ti质粒丢失的概率极低(可以忽略)。

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